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ZFusion One Step Cloning  Kit

單步驟快速載體構築試劑盒(無縫接合試劑盒)
• 簡單、快速、高效,適用於任何載體
• PCR產物無需限制酶切;不依賴於連接酶(Sub-cloning is unnecessary : Clone any insert, into any location, within any    vector)
•  有效cloning 50 bp-10 kbp DNA片段
•  PCR產物可不進行純化直接cloning
•  可用於DNA高效定點突變


應用 Applications
•PCR cloning
•Multiple fragment cloning
•Gene synthesis
•Gene design
•Domain swapping
•Domain modification
•Mutagenesis

產品描述:
ZFusion技術是一種簡單、快速並且高效率DNA directed cloning技術,可將插入片段PCR產物directed  cloning至任意載體的任意位點。將載體進行線性化,並在插入片段PCR引子5’端引入線性化載體的末端序列,使得PCR產物5’和3’最末端分別帶有和線性化載體兩末端一致的序列(15 bp~20  bp)。這種兩端帶有載體末端序列的PCR產物和線性化載體按一定比例混合後,在Exnase的催化下,僅需反應 30 min即可進行轉化,完成定向clone,成功率可達95%以上。ZFusion是新一代的重組克隆試劑盒,包含增強的重組酶Exnase II。和上一代產品相比,Exnase II中添加了獨特的重組增強效果。一方面,這種增強效果可以有效提高重組Cloning效率,即便使用一般competent cell(10^7 cfu/μg)也可實現高效克隆(100 cfu/ng Vector)。另一方面,Exnase II還相容一般酶切、PCR反應。載體的酶切或PCR產物和插入片段PCR產物可以不進行DNA純化,直接用於重組克隆,大大的簡化了實驗步驟。
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使用ZFusion進行基因克隆實驗流程。用於重組反應的克隆載體必須為線性化載體。該線性化載體可通過內切酶酶切環狀載體獲得,也可由反向PCR擴增環狀載體獲得(上左)。
插入片段由PCR放大製備。所用放大引子在設計時需在其5’端添加線性化克隆載體末端序列(圖中以紅色和藍色標記)。
使用該引子對放大插入片段,放大產物 5’ 和3’ 最末端的序列分別和線性化克隆載體兩末端序列完全一樣(上右)。
以線性化克隆載體和插入片段放大產物進行重組反應,37℃反應30 min即可完成重組反應,實現兩線狀DNA的體外環化(中)。重組產物直接進行transformation,平板上會形成數百個單克隆供後期陽性篩選(下)。
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從λDNA中擴增0.5 kb、1 kb、2 kb片段,使用ZFusion MultiS One Step Cloning Kit將其順序重組至pUC 19 EcoRI和HindIII位點之間。重組反應transformation後平板上形成了數百個克隆,而無插入片段的陰性對照反應轉化後只有少數clone形成。
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菌落PCR鑒定重組質體。重組反應transformation後平板上形成了數百個clone中挑取14個進行菌落PCR鑒定。M:Marker III;1-14,  14個clone。如果菌落為自連載體transformation形成,則PCR band 應為150 bp左右;如果片段成功插入載體,則PCR band應為3.5 kb左右。所鑒定clone有13個為陽性。

ZFusion Multis One Step Cloning Kit
單步驟快速多片段載體構築試劑盒 (多片段無縫接合試劑盒)
• 適用於向幾乎任何載體在任何位點進行多片段組裝clone
• 無需考慮插入片段自身攜帶的酶切位點
• 可一次實現多至五個插入片段的順序組裝
• 線性化clone載體和PCR產物可不進行純化直接clone


產品描述:
ZFusion
技術是一種簡單、快速並且高效的DNA定向clone技術,可將插入片段PCR產物定向clone至任意載體的任意位點。將載體進行線性化,並在插入片段PCR引子5’端引入線性化載體的末端序列,使得PCR產物5’和3’最末端分別帶有和線性化載體兩末端一致的序列(15 bp~20 bp)。這種兩端帶有載體末端序列的PCR產物和線性化載體按一定比例混合後,在Exnase的催化下,只需反應30 min即可進行transformation,完成定向clone,成功率可達95%以上。
ZFusion Multis
針對多片段clone開發,試劑盒中包含有專門針對多片段重組優化的buffer和重組酶Exnase Multis。使用本試劑盒,可以將多至五個片段一次性順序組裝。此外,Exnase Multis還相容常規酶切、PCR反應體積。載體酶切或PCR產物以及插入片段PCR產物可以不用純化直接進行反應,極大的簡化了實驗步驟。


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圖1.使用ZFusion Multis進行多片段組裝clone實驗流程
用於重組反應的clone載體必須首先線性化。線性化可通過酶切或反向PCR獲得(圖,上左)。插入片段由PCR製備。所用放大引子在設計時需在其5'端添加同源序列(圖中以深藍色、深灰色、淺藍色和紅色標記),使得放大產物之間以及放大產物與線性化clone載體之間都具有能夠相互同源重組的一致序列(圖,上右)。在Exnase TM Multis的催化下,線性化載體和插入片段只需在37
℃
反應30 min即transformation,實現多片段順序組裝並clone至目標載體(圖,中)。

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圖2.從λDNA中放大0.5 kb、1 kb、2 kb片段,使用ZFusion Multis One Step Cloning Kit將其順序重組至pUC 19 EcoRI和HindIII位點之間。重組反應transformation後plate上形成了數百個單clone,而無插入片段的陰性對照反應transformation後只有少數單clone形成。
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圖三:菌落PCR確認重組子。重組反應transformation後plate上形成了數百個單clone中挑取14個進行菌落PCR確認。M:Marker III;1-14, 14個單clone。如果菌落為自連載體transformation形成,則PCR band應為150 bp左右;如果片段成功插入載體,則PCR band應為3.5 kb左右。所確認clone有13個為成功。

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